Bakgrund: Bakterien Neisseria gonorrhoeae orsakar gonorré som kan resultera i allvarliga komplikationer som exempelvis sterilitet. På senare år har antalet gonorréfall ökat i Sverige (596 fall under 2003). För att reducera förekomsten är en effektiv diagnostik, antibiotikabehandling, epidemiologisk karakterisering av bakterierna, aktiv smittspårning och information till breda grupper för att förändra sexuella beteenden nödvändigt.

Traditionellt har man för epidemiologiska syften, exempelvis partnerspårning, karakteriserat bakterierna med hjälp av antikroppar. Indelningen sker i olika serologiska varianter (serovarer) beroende på hur proteinet porb ser ut på ytan av bakterierna. Metoden har nackdelar som bristfällig diskriminering (förmåga att särskilja olika bakteriestammar) och reproducerbarheten är inte optimal.

Syfte: Att utveckla en snabb och effektiv dna-baserad karakteriseringsmetod för N gonorrhoeae lämplig för epidemiologiska syften.

Metod: Masskopiering av porb-genen med automatisk bedömning av genens storlek. Metoden kallas realtids-pcr med smältpunktsanalys. På detta sätt identifierades vilken variant av genen (genogrupp) som bakterieisolaten hade, porb1a eller porb1b.

Sex korta, mycket variabla delar av genen bestämdes sedan dna-bas för dna-bas med hjälp av dna-sekvensering i realtidsformat (pyrosekvenserings-teknologi). Beroende på hur de olika dna-sekvenserna såg ut i de högvariabla delarna delades slutligen isolaten in i olika genetiska varianter (genovarer).

Resultat: Pyrosekvenseringen var en mycket snabb metod. Inom loppet av 1,5 timmar studerades 96 sekvenser. Resultaten var reproducerbara och i överensstämmelse med traditionell dna-sekvensering (»Sangersekvensering«). Isolat som var skilda när man studerade hela porb-genen, 22 porb1a-isolat och 65 porb1b- isolat, kunde delas in i 22 respektive 64 unika genovarer. Diskrimineringen var således nästan identisk mellan bakteriestammarna. Detta oavsett om korta högvariabla delar av porb-genen (några hundra dna-baser) analyserades eller hela genen studerades (cirka 1 000 dna-baser).

Slutsats: Genogrupp- och genovarbestämning där man studerar korta, högvariabla delar av porb-genen hos n gonorrhoeae är snabb, högdiskriminerande, objektiv, reproducerbar samt har hög kapacitet. Metoden skulle kunna ersätta alternativt komplettera den bristfälliga men internationellt etablerade och rutinmässigt använda bestämningen av serovarer för att identifiera spridningen av individuella bakteriestammar.

Med denna nya dna-baserade metod får man en ökad förståelse för hur gonorré sprids i samhället. Detta är information som kan effektivisera epidemiologiska utredningar, partnerspårning och smittskydd, vilket leder till minskad spridning av gonorré.

 

KOMMENTAR AV BENGT WRETLIND:

Gonorré kan i vissa fall orsaka komplikationer som sterilitet och extrauterina graviditeter. Bakterien försvarar sig aggressivt mot terapi genom att utveckla resistens mot olika antibiotika.
Det krävs goda laboratoriemetoder för att påvisa gonokocker i odlingsprov. Bakterierna är ömtåliga och dör om transporttiden blir lång och odlingsplattorna kan ibland bli övervuxna med ovidkommande bakterier.

PCR-metoder för att påvisa gonokocker finns på marknaden men har så vitt jag vet inte använts i någon större utsträckning i Sverige.

Det finns flera problem med PCR-metoden. Den kan ge falskt positiva reaktioner, sannolikt orsakade av andra, ofarliga Neisseria-arter. Dessutom får vi ingen bakteriestam att resistensbestämma eller typa för epidemiologiska studier. Vi har dock utvecklat en PCR-metod för samtidig verifiering av positiva PCR-reaktioner och bedömning av känsligheten för ciprofloxacin.

För att bekämpa gonorré behövs effektiv spårning av kontakter för att bryta smittkedjorna. Magnus Unemos utmärkta avhandling behandlar epidemiologisk typning av Neisseria gonorrhoeae med molekylära metoder. Den traditionella metoden att typa gonokocker är baserad på antikroppar mot ett membranprotein, porb. Alla som sysslat med agglutinationsreaktioner vet att skalan positiv-tveksam-negativ är flytande, och att det krävs erfarenhet för bedömningen. Dessutom kan kvaliteten på antikropparna variera mellan olika satser.

Den intressantaste nya typningsmetoden är den som Unemo och medarbetare utvecklat: sekvensering av variabla delar av genen för porb. Pyrosekvensering är snabb, enkel att utföra och passar bra för detta ändamål. Fördelen med molekylär typning är att metoden är objektiv och reproducerbar. Bakterierna förändras hela tiden, vilket försvårar traditionell serologisk typning. Detta problem har inte metoder baserade på dna-sekvenser.

Man kan dessutom förutse att dna-sekvensering blir ännu billigare och enklare i framtiden. Då får vi ett kraftfullt verktyg för epidemiologiska undersökningar och smittspårning. Liknande metoder har utvecklas för några andra bakterier, t ex Chlamydia trachomatis, vilket också utförts i Örebro. Det är också möjligt att sekvensering av gonokockens porb-gen kan utföras på samma prov som pcr-diagnostiken, som i så fall skulle kunna utvecklas till ett acceptabelt alternativ till odling.

BENGT WRETLIND
Professor i klinisk bakteriologi, överläkare vid avdelningen för klinisk bakteriologi, Karolinska universitetssjukhuset i Huddinge.